Microbiome | 中国农科院王加启/赵圣国构建微球原位培养方法实现牛瘤胃重要尿素分解菌分离...

构建微球原位培养方法实现牛瘤胃重要尿素分解菌分离

Functional gene-guided enrichment plus in situ microsphere cultivation enables isolation of new crucial ureolytic bacteria from the rumen of cattle

Microbiome [IF: 16.837]

DOI：10.1186/s40168-023-01510-4

发表日期：2023-04-15

第一作者: 刘思佳

通讯作者：王加启 (jiaqiwang@vip.163.com)、赵圣国 (zhaoshengguo1984@163.com)

主要单位：中国农业科学院、兰州大学、俄亥俄州立大学、英国贝尔法斯特女王大学

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所奶业创新团队在瘤胃尿素分解菌分离培养方面取得新进展。研究构建了一种基因富集结合微球原位培养的分离方法，实现了微生物高通量分离，并利用该方法从瘤胃中分离鉴定了具有脲酶活性的重要尿素分解菌，大大丰富了瘤胃微生物组资源，有助于弥合未培养细菌基因型和表型之间的鸿沟。相关研究成果于2023年4月发表在《Microbiome》上。

研究背景

在反刍动物中，肝脏产生的尿素有40% - 80%返回胃肠道，特别是瘤胃。返回到瘤胃的尿素被尿素分解菌分泌的脲酶水解为二氧化碳和氨，氨被微生物利用合成微生物蛋白。微生物蛋白是奶和肉的主要氮来源。因此，牧场常使用尿素部分代替反刍动物日粮中的优质蛋白饲料，以降低饲养成本。但是，瘤胃中尿素分解菌分泌的脲酶活性过高，尿素水解过快，导致大量尿素通过尿液排出体外，不仅导致尿素氮利用效率低，还污染环境。因此，瘤胃中的尿素分解菌引起了大量研究者的兴趣。

基于培养和测序的研究都试图揭示瘤胃尿素分解菌的多样性及其功能。目前，分离培养的瘤胃尿素分解菌大多来自于上个世纪，是通过传统的平板划线的方法获得的，这种方法费时费力。在以往的研究中，只有少数几种瘤胃尿素分解菌被分离出来，但通过高通量测序技术却揭示了其具有高度多样性，有近千个菌种。虽然基于测序技术有助于对瘤胃生态系统中尿素分解菌的多样性和分布有一些新的认识，但对其代谢、生理和生态仍然知之甚少。瘤胃尿素分解菌的分离和鉴定对于直接评估其基本生物学过程和特征至关重要，这为提高反刍动物尿素利用效率提供了新的、高效的、可行的干预措施。

从瘤胃中分离新的尿素分解菌是困难的，因为它们是厌氧细菌，且在瘤胃中丰度较低。此外，研究者对其营养物质和生长因子的需求知之甚少，无法靶向制定合适的培养基及培养条件。此外，许多微生物在其栖息的自然生态环境中需要交叉喂养或与其他群落成员密切交流才能生长。原位培养是模拟细菌在瘤胃中的生长条件，克服了平板划线分离方法的缺点，促进了微生物的分离效率。样品梯度稀释有助于分离优势菌群。研究人员开发了几种新的微生物分离技术，例如芯片、培养组学、单细胞分离和微流控等，以提高从不同环境中分离难以培养细菌的成功率。然而，这些技术需要昂贵的设备，而且分离微生物时并不是针对某些具有特定功能的群体。此外，由于尿素分解菌在瘤胃中的丰度较低，在分离之前进行富集将有助于提高分离效率，但使用选择性碳或氮源无法有效地富集它们。在本研究中，我们结合ureC基因富集、琼脂糖微球包裹单细胞和原位共培养的方法从牛瘤胃中分离出尿素分解菌。然后，我们对分离出的尿素分解菌进行全基因组测序，以确定其多样性和分布，揭示了脲酶基因簇类型和脲酶活性。

1. 靶向分离尿素分解菌方法概述

我们建立了一种靶向分离尿素分解菌的方法，通过功能基因ureC富集靶标菌群，将单细胞包裹到琼脂糖微球中，在模拟的瘤胃环境中培养，最后通过基因组测序进行鉴定（详细流程见图1）。该方法的优点包括：利用96孔板提高了通量；利用功能基因ureCPCR筛选富集靶标菌群；利用琼脂糖微球包裹置于原位环境中孵育，使需要未知生长因子及需要与其它细菌互作的微生物生长；基因组测序揭示完整的脲酶基因簇特征。我们优化了接种物(瘤胃液)的稀释度，然后将富集的尿素分解菌群，稀释后包裹到琼脂糖微球中。连续稀释后的瘤胃液于39℃孵育24 h，孵育结束后，利用ureC特异性引物PCR筛选，结果显示，大于10^-1稀释度的板子只有部分孔中存在尿素分解菌，10^-5及以上稀释度的板子中均未检出尿素分解菌。本研究中，10^-4稀释度最可能将尿素分解菌分离成单菌株，因此选择10^-4稀释度作为富集尿素分解菌的最佳稀释倍数。

图1. 瘤胃厌氧尿素分解菌的富集、分离和基因组特征研究流程

我们将富集的尿素分解菌进行梯度稀释，将其包裹至琼脂糖微球中，然后在一个模拟瘤胃的环境中进行培养，该系统允许置于透析袋内的琼脂糖微球中包裹的尿素分解菌与透析袋外的瘤胃微生物群进行交叉喂养。琼脂糖微球的平均直径为3.4±0.1mm(±SD)。对每个琼脂糖微球中菌落的16S rRNA基因扩增并测序分析表明，随着稀释度的增加，包裹细菌琼脂糖微球的比例减少，但包裹单细胞琼脂糖微球的比例增加。其中10^-9和更高稀释度的样品，包裹单细胞微球的比例为100%。为了最大限度地从每个微球中分离出单菌株，我们选择10^-10稀释度，进行后续研究中单菌株的分离。

培养时间是影响微球包裹单菌株分离成功的另一个重要因素。随着孵育时间增加(12-72 h)，含有细菌微球的比例增加，而含有单菌株微球的比例下降。为了最大限度地从每个微球中分离出单菌株，我们选择孵育24h，进行后续研究中单菌株的分离。

我们采用非靶向代谢组学对透析袋内外的代谢产物进行了分析，以评估透析袋内外微生物代谢产物的差异，确保模拟的瘤胃环境中透析袋外的瘤胃微生物能够为嵌入在透析袋内琼脂糖微球中的细菌提供营养物质和生长因子。我们在透析袋和模拟的瘤胃发酵系统中共检测到4224种代谢物，其中109种可被识别分类。所有这些代谢物均在透析袋放入模拟发酵系统的6 h后被检测到。通过聚类分析发现，透析袋内外的代谢物分布随发酵时间的变化而变化，但同一时间基本相似。透析袋内外代谢物在各发酵时间的相关系数为0.96-0.98。

2. 分离的尿素分解菌菌株的基因组学分类

本研究共分离到了976个菌株，其中将16S rRNA基因以100%相似性进行聚类后共得到404个菌株，将16S rRNA基因以98%相似性进行聚类后共得到52个菌株，对这52株菌进行全基因组测序和基因注释，共得到28株携带脲酶基因的菌株。28个菌株的基因组大小范围为1.8 - 7 Mbp，完整度>90%，污染度<7%。根据平均核苷酸同源性阈值（种<95%、属<90%），分离到的28株菌分布在11个菌属12个菌种。利用GTDB-TK软件对28株菌进行物种分类，结果显示12个菌种分别为Pseudomonas stutzeri (1株)、Proteus penneri (1株)、Klebsiella pneumoniae (6株)、Enterobacter hormaechei (1株)、E. cloacae (1株)、Citrobacter koseri (2株)、C. farmeri (1株)、C. amalonaticus (2株)、Paraclostridium bifermentans (1株)、Clostridium butyricum (4株)、Aliarcobacter butzleri (3株) 和 Corynebacterium vitaeruminis (5株)。尿素分解菌菌株占基因组测序菌株的48%。除了菌株S90.1 (P. bifermentans)、S92.1 (E. hormaechei)和S48 (E. cloacae)外，其他尿素分解菌基于基因组和ureC构建的系统发育树基本相似，表明ureC基因可作为尿素分解菌分类的系统发育标记基因。

图2. 分离的尿素分解菌的物种分类及系统发育

3. 评估微球原位分离方法的先进性

本研究分离出的12种尿素分解菌与之前9项研究中分离出的尿素分解菌不同。与以往所有的研究相比，本研究扩大了分离尿素分解菌的数量。在瘤胃Hungate1000项目中，共有17种尿素分解菌携带脲酶基因，根据BacDive数据库推断其中3种(1.7%)具有脲酶活性。在之前的10项研究中，共从瘤胃中分离出35种尿素分解菌，根据BacDive数据库推断其中24种具有脲酶活性。本研究对12种新分离的尿素分解菌的尿素水解能力进行了测定，结果显示均可水解尿素。本研究将现有资源库中携带脲酶基因的菌种数量增加了34.38%，具有脲酶活性的菌种数量增加了45.83%。

图3. 新尿素分解菌与以往研究的比较

4. 新尿素分解菌的分布

我们通过将分离尿素分解菌的基因组序列比对到不同反刍动物(包括山羊、狍子、绵羊、奶牛、牦牛和水牛)的宏基因组，以评估其分布情况。根据匹配率评估尿素分解菌在上述反刍动物瘤胃的相对丰度，以及与尿素摄入量和乳品质的关系。结果显示，所有新分离的尿素分解菌在上述6种不同反刍动物中都有分布，但相对丰度存在差异。除了狍子、水牛和山羊，来自同一反刍动物物种的菌株聚集在一起。P. penneri、K. pneumoniae、C. koseri、C. farmer 和 C. amalonaticus 在奶牛瘤胃中的相对丰度高于其他5种反刍动物。在相对丰度较高的10个菌株中，有8个来自本研究。与以往的研究相比，本研究分离出的尿素分解菌覆盖了低丰度菌。我们发现，饲料中添加尿素降低了绵羊瘤胃中A. butzleri、C. vitaeruminis、E. cloacae、C. koseri、C. butyricum和 P. bifermentans 菌株的相对丰度，增加了E. hormaechei、K. pneumoniae和P. stutzeri 菌株的相对丰度。此外，有22株(占总数的51%)尿素分解菌与奶牛乳蛋白水平显著相关，其中本研究分离的占64%。乳蛋白水平高的奶牛中P. penneri、K. pneumoniae和P. stutzeri 分离株相对丰度较高，C. vitaeruminis、A. butzleri、C. koseri、C. amalonaticus 和 C. butyricum 分离株相对丰度较低。

图4. 尿素分解菌菌株的相对丰度、分布和作用

5. 尿素分解菌的独特基因和糖苷水解酶家族

我们将分离到的28个尿素分解菌菌株的基因组与前人分离的尿素分解菌进行了泛基因组比较。所有新分离株均具有独特的基因家族，占全部基因的0.07% - 9.87%。随着基因组数量的增加，每个物种的泛基因组大小都在增加，但并没有达到一个平台，表明这些物种的泛基因组处于开放状态。根据独特基因家族的数量和较高的注释率，选择3个物种(C. butyricum、P. bifermentans、K. pneumoniae)进行独特基因家族的分布研究。我们分别从C. butyricum、P. bifermentans和K. pneumoniae 的基因组中发现了65个、2662个和2637个核心基因家族。C. butyricum共有57株，其中本研究分离到4株，这4株新菌株包含3 - 420个独特基因家族，其中菌株S11数量最多。P. bifermentans 共有16株，其中本研究分离到1株，包含73个独特基因家族。K. pneumoniae 共有79株，其中本研究分离到6株，这6株新菌株包含3 - 254个独特的基因家族。鉴定到的大部分独特基因家族都与碳氮代谢相关。菌株C. butyricum S11独特的基因家族涉及脂肪酸代谢、碳水化合物代谢和谷胱甘肽生物合成。菌株P. bifermentans S90.1独特的基因家族涉及固氮和菌毛合成。K. pneumoniae 菌株独特的基因家族涉及L-阿拉伯糖、甲酸酯、L-苏糖醇、D-半乳糖和D-木糖代谢，以及谷胱甘肽、缬氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、L-苏氨酸、丙氨酸、赖氨酸和精氨酸代谢。有趣的是，研究发现K. pneumoniae S26、S96和S97具有一个独特的尿素代谢基因家族——尿素羧化酶，该基因与脲基甲酸酯水解酶共同发挥作用。

在瘤胃中以多糖为主要的碳源和能量来源，因此我们利用dbCAN和CAZy数据库分析了28个尿素分解菌菌株的基因组，以揭示糖苷水解酶家族（GHs）的分布。我们鉴定到了参与不同类型多糖水解的GHs，包括淀粉、半纤维素、纤维素和低聚糖。同一物种的不同菌株具有相似的GHs类型和家族。C. amalonaticus、C. farmeri、C. koseri、C. butyricum、E. cloacae、E. hormaechei 和 K. pneumoniae 的菌株均含有淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶和低聚糖降解酶，说明它们可以广泛利用多糖，有助于反刍动物饲料消化吸收与利用。

图5. 尿素分解菌泛基因组分析

6. 脲酶基因簇多样性、脲酶活性及关键

氨基酸残基

脲酶基因在尿素分解菌的基因组中通常以簇的形式出现，包括3个结构基因(ureA、ureB、ureC)和附属基因。在本研究携带脲酶基因的分离株中，我们发现了5种类型的脲酶基因簇。这些基因簇均具有上述3种结构基因，但附属基因的数量或顺序不同。在V型脲酶基因簇中，ureC 和 ureE之间存在多个开放阅读框。与其他类型相比，IV型和V型脲酶基因簇中包含编码镍跨膜转运蛋白的ureJ。

所有尿素分解菌菌株均具有脲酶活性，但尿素水解和尿素利用能力不同。菌株P. penneri S99的尿素水解率最高，菌株C. amalonaticus S106的尿素水解率最低。同一种菌种不同菌株的尿素水解能力存在差异，如K. pneumoniae、C. koseri、C. amalonaticus 和 A. butzleri。培养基中尿素的水解率分别为K. pneumoniae 20% - 54%、C. koseri 11% - 42%、C. amalonaticus 2% - 27%和A. butzleri 13% - 28%。然而，它们利用尿素水解产生的氨氮的能力与水解尿素的能力并不一致。其中，菌株P. bifermentans S90.1尿素氨氮利用率最高，但尿素水解效率较低。

尿素水解率与脲酶基因簇类型之间没有关系，相同的脲酶基因簇类型的菌株之间尿素水解能力存在差异。具有脲酶基因簇类型I的菌株尿素水解率变异最大。我们将I类型脲酶基因簇菌株携带脲酶活性中心的UreC的氨基酸序列进行比对，以揭示其调控脲酶活性的潜在机制。同一菌种不同菌株的UreC序列几乎相同(99-100%)，而不同菌种间菌株的UreC序列相似性较低(91-98%)，其中菌株S99的UreC序列与其他菌株/种的UreC序列相似性仅为71-73%。在利用UreC氨基酸序列构建的系统发育树上，菌株S99单独为一个分支。我们对菌株S99的UreC活性中心的关键催化残基(His¹³⁴、His¹³⁶、Lys²¹⁷、His²⁴⁶、His²⁷²、Asp³⁶⁰)进行比对，发现菌株S99的UreC活性中心的关键催化残基是保守的。然而，与其他携带I型脲酶基因簇的分离株相比，菌株S99在覆盖活性中心柔性环的皮瓣区域有3个突变的AAs残基(Val³⁰⁹、Ser³²⁵、Pro³²⁷)。Ser³²⁵和Pro³²⁷位于控制活性中心打开或关闭的转折区域。这两个AAs残基可能是控制S99脲酶活性关键位点。

图6. 脲酶基因簇及分离菌株尿素水解能力的研究

7. 全文结论

本研究采用脲酶基因富集结合微球原位培养的方法，从瘤胃中分离出尿素分解菌。我们分离并鉴定了多种具有脲酶活性的尿素分解菌，这些新分离的菌株以前未从瘤胃中培养过。其中一些新分离菌株可能在氮代谢，特别是尿素代谢中发挥重要作用。这些菌株可作为模型菌进一步了解瘤胃中氮代谢，特别是尿素代谢，以提高尿素利用率。新方法还将有助于分离其他环境中感兴趣的未培养微生物，以更好地弥合未培养细菌基因型和表型之间的鸿沟。

资助情况

研究成果于2023年4月发表在《Microbiome》杂志。该成果由国家自然科学基金项目、国家奶牛产业技术体系、中国农业科学院科技创新工程和动物营养学国家重点实验室自主课题资助.

参考文献

Sijia Liu, Zhongtang Yu, Huiyue Zhong, Nan Zheng, Sharon Huws, Shengguo Zhao*, Jiaqi Wang*. Functional gene-guided enrichment plus in situ microsphere cultivation enables isolation of new crucial ureolytic bacteria from the rumen of cattle. Microbiome 2023:76

作者简介

通讯作者

王加启

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 研究员

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所奶业创新团队首席专家，农业农村部食物与营养发展研究所所长，全国农业科研杰出人才。主要从事奶牛营养与牛奶质量安全研究。获得国家科技进步奖二等奖3项，发表SCI论文百余篇，担任《Journal of Dairy Science》编委。

通讯作者

赵圣国

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 副研究员

2012年获中国农业科学院博士学位，2011-2012年在澳大利亚CSIRO Livestock Industries做联合培养博士生，2012-2014年在中国科学院微生物研究所博士后工作，2014年至今在中国农业科学院北京畜牧兽医研究所工作。主要从事动物消化道(瘤胃)微生物组学研究，揭示营养素、微生物和动物机体之间的互作关系。主持国家自然科学基金等国家级项目或子课题2项，获神农中华农业科技奖等科技奖励3项，入选农业农村部“杰出青年农业科学家”。以第一或通讯作者(含共同)发表论文67篇，其中在Microbiome、Applied and Environmental Microbiology、Frontiers in Microbiology、Journal of Dairy Science等期刊发表SCI论文37篇，出版《益生菌与动物营养——生产、效果和规范》书籍。兼任《Animal》和《生物技术通报》杂志编委，国际学术组织Metaproteomics Initiative和Anaerobic Fungi Network专家组委员。

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