无法在只读编辑器中编辑_Mol Plant中国农科院作物科学研究所夏兰琴课题组成功利用 优化的引导基因编辑器在水稻中实现高效精准基因编辑...

近日，中国农业科学院作物科学研究所夏兰琴实验室利用水稻密码子优化的nCas9 (H840A)蛋白和逆转录酶突变体(M-MLV-RT)的融合基因，开发了一种高效的植物引导编辑(Prime Editing)系统，成功精准编辑了水稻的外源hptII突变基因和内源OsEPSPS基因，获得了精准编辑纯合和杂合植株，拓展了植物基因组精准编辑工具。相关研究成果于2020年3月25日在线发表于Molecular Plant杂志上。

https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.03.011

对重要农作物基因组进行定点修饰，包括关键基因的定点敲除、等位基因替换以及外源基因的定点整合等，将有助于重要农艺性状的功能基因鉴定、复杂农艺性状的调控网络解析和新种质创制，对加快农作物遗传改良进程具有重要意义。

近年来，CRISPR/Cas介导的植物基因组定点编辑、单碱基替换和同源重组体系的建立和利用，在农作物基因功能研究和精准育种中发挥了重要作用，展现了广阔的发展潜力和应用前景。然而，CRISPR/Cas介导的植物基因组定点敲除技术只能在基因组特定位点产生随机插入和删除。由CRISPR/Cas系统衍生的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器，只能在基因组靶向位点实现C→T，G→A，A→G和T→C等4种单碱基转换，还不能实现其它类型的碱基颠换。通过同源定向修复(HDR)技术，进行基因组精确编辑，在植物中的效率依然非常低，只在少数实验室可行。因此，迫切需要建立更高效的植物基因组精准编辑技术体系。

此前，哈佛大学David R. Liu教授研究团队,通过将Cas9缺刻酶nCas9 (H840A)与逆转录酶突变体(Engineered M-MLV-RT)融合，在哺乳动物中开发了一系列新的基因组精准编辑体系-引导编辑系统(prime editors)。该系统能够在不存在DNA双链断裂缺口和DNA供体修复模板的情况下，即可实现靶向插入、删除和所有类型的单碱基自由转换和颠换，为提高作物精确编辑效率提供了可能。

在引导编辑系统中，引导编辑作用的pegRNA(prime editing guide RNA)，通过在sgRNA骨架的3’端引入引物初始结合位点(Primer binding site，PBS)序列结合nCas9断裂的非靶标链，以pegRNA上携带目标突变的逆转录本(RT)为模板，通过延申，产生含有目的突变的单链DNA。细胞进一步通过DNA损伤修复和复制把目的突变引入基因组。此外，在非编辑链上引入能产生缺刻的sgRNA，有助于提高引导编辑的效率。

植物引导编辑系统对外源hptII突变基因和内源EPSPS基因的精准编辑

基于动物引导编辑系统，夏兰琴实验室进一步优化该系统，构建了高效植物引导编辑体系。将水稻密码子优化的逆转录酶突变体(Engineered M-MLV-RT)融合在具有双核定位信号的nCas9(H840A)蛋白的C末端，使用玉米增强型启动子Ubiquitin启动子驱动该融合基因表达，并添加了具有增强mRNA稳定性的PolyA结构和豌豆Rubisco小亚基E9终止子终止转录和翻译；进一步，使用水稻组成型Actin启动子驱动pegRNA和sgRNA的共表达，采用体内可自我剪切的tRNA间隔，同时添加了PolyA结构和Nos终止子以增强转录本的稳定性和提高表达量，构建了高效的植物引导编辑系统 (prime editor-basic)。利用上述植物引导编辑系统，通过靶向水稻外源hptII突变基因和内源OsEPSPS基因进行精准基因编辑，T0代成功地获得了15株hptII精准修饰纯合植株和1株OsEPSPS基因精准修饰杂合植株，精确编辑效率分别为9.38%和2.22%。

高效植物引导编辑系统的建立，为水稻以及其他作物基因组精确编辑提供了有效工具，有望大大促进农作物定向遗传改良的进程。

作科所博士研究生李慧园，李晶莹和博士后陈继林为本文共同第一作者，夏兰琴研究员为本文通讯作者。本研究得到转基因重大专项和中国农科院创新工程与‘农科英才’特支计划项目资助。

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总结

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